Mammary Tumor Organoid Culture in Non-Adhesive Alginate for Luminal Mechanics and High-Throughput Drug Screening

　　一种基于海藻酸液滴的乳腺肿瘤类器官培养方法，用于药物筛选。

Introduction

　　思路：

• 乳腺肿瘤类器官比二维培养更能复现其病理生理环境。三维环境的维度和空间拓扑允许细胞聚集、相互作用，并显示类似于在体内模型中发现的表型。不同肿瘤相关细胞类型和ECM的动态的细胞相互作用调节肿瘤发生、侵入和运动。
• 水凝胶以其能提供物理支持、机械线索和细胞连接位点而获得关注。能够这促进具有层次结构或管腔结构的高度有序的类器官的形成。最常用于类器官培养的材料是肿瘤来源的基底膜提取物（BME），但其存在制造成本高、批次差异和温度敏感的问题，因此人们开发了合成聚合物如聚乙二醇水凝胶和天然衍生的聚合物如纤维蛋白来培养人类肠道类器官。这些合成水凝胶允许研究人员通过添加化学定义的配体和分子（如RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）和层粘连蛋白-111）来调整其生化成分，作为对发展上皮类器官的补充。
• 当前研究需要类器官的高通量培养和分析，以扩展在药物筛选和个性化医疗中的应用。微流控和微加工技术已被用于增加类器官培养的通量。但Matrigel的严格储存和凝胶化仍然是微流控装置设计和应用中的一个挑战。
• 海藻酸是一种从褐藻中提取的天然聚合物，由于其与二价阳离子（如Ca2⁺，Ba2⁺）温和而快速的凝胶化、高生物相容性、低免疫原性和低成本，已被广泛地使用微流控液滴技术进行研究。由于海藻酸盐是相对生物惰性的，嵌入海藻酸盐的细胞不能分化成有序结构或典型的类器官。为了克服这个缺点：
  • 海藻酸盐可以通过添加化学粘合剂和水解位点进行功能化。
  • 另一种策略是将海藻酸盐作为一个外部支架，细胞可以用Matrigel、胶原蛋白或甚至用于类器官培养的培养基封装在核心部位。
• 本文中，作者在用液滴微流控设备生成的非粘性海藻酸盐微球中，生成了小鼠肿瘤碎片来源的乳腺肿瘤类器官。海藻酸盐微球内的肿瘤碎片形成了两种类型的器官：管腔型和实质型。流式细胞仪分析表明，建立的类器官显示出与新鲜肿瘤相似的细胞室（cell compartments，不知道如何翻译）。利用厚壁压力容器（TWPV）模型，分析了从海藻酸盐微球到腔内类器官的机械力，随后进行了微孔阵列上的肿瘤类器官的药物敏感性分析。作者发现，药物反应与类器官的大小和力学高度相关。

Design Concept of the High-Throughput Mammary Tumor Organoid Culture in Alginate Microbeads

• （a）在乳腺内，导管由被肌上皮细胞包围的单层管腔上皮细胞组成。排列在上皮腺泡和导管上的细胞不受控制的生长导致乳腺肿瘤的形成。
• （b）肿瘤被切碎为肿瘤块，并通过孔径为200 µm的过滤器过滤。
• （c）肿瘤块（<200 µm）与海藻酸盐/Ca2⁺-EDTA 混合，随后将其封装在微流控芯片中的海藻酸盐液滴内。被EDTA螯合的Ca2⁺在暴露于酸性环境后迅速释放以诱导海藻酸盐微珠的凝胶化。从油中提取海藻酸盐微凝胶球，然后在组织培养板中培养。海藻酸盐包裹的肿瘤块在培养中生长了几天，观察到一半的类器官开始形成管腔型结构。这些管腔结构被发现是上皮类器官的典型形态，也有报道称其在基质胶培养中形成。
• （d）这些乳腺肿瘤的类器官可以用于高通量药物筛选、类器官水平的机制分析、疾病机制、治疗响应、克隆进化和耐药性出现的研究。

Growth of Mammary Tumor Organoids in Alginate Microbeads

• （a）4×物镜下的微流控芯片通道。
• （b）大小均匀的荧光海藻酸盐微球。
• （c）含乳腺肿瘤类器官的海藻酸盐微球的高通量生成。通道中的碎片干扰了流动，导致微球的大小相对不均匀。
• （d）微球中管状乳腺肿瘤类器官的放大视图。
• （e）140 µm管状类器官的3D示意图：Z轴内的核映射（上图）；z = 63 µm处的横截面视图（下右）；类器官的白光图（下左）。
• （f）五天内管腔类器官的生长。直径增长从60—180 µm，大约30 µm每天。
• （g）含有仅管状类器官、实质类器官、管状/实质类器官和不含类器官的分散细胞的海藻酸盐微球的百分比。
• （h）具有光滑边界（I）、块状结构（II）、“葡萄状”结构（III）和不粘性簇（IV）的实质类器官。
• （i）第14天海藻酸盐微球中乳腺肿瘤类器官的活力。
• （j）海藻酸盐微球中大量管状类器官的生长。作者还将MCF-7细胞嵌入海藻酸盐微球内，然而没有形成管状结构，只有少量载有细胞的微球可以产生实心多细胞肿瘤球，大多数细胞在微球内保持活力，但没有显示出增殖迹象。该结果表明MCF-7细胞系不保持管状祖细胞能力，因此它们不能在海藻酸盐基质内产生必要的细胞锚定物。大多数情况下，海藻酸盐需要用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）进行功能化，以使细胞与支架结合。间质细胞的共同培养对于在非粘性海藻酸盐中形成类器官十分重要，本工作中乳腺类器官的形成是因为含有各种细胞类型和ECM的混合物的肿瘤碎片被嵌入海藻酸盐中。

Cell Compartment of Organoids in Alginate Microbeads

• （a-b）乳腺组织包含管腔和基底上皮谱系。只有管腔细胞由HR⁺和HR^-群体组成，而基底细胞仅包括HR^-细胞。培养两周后，CD45⁺细胞的百分比从新鲜肿瘤中的5.15%降低到藻酸盐微珠中的0.88%。表明封装在海藻酸盐微球内的免疫细胞无法在培养基组合物中存活。在新鲜肿瘤中，管腔细胞（EpCAM⁺，CD49f_lo）和基底细胞（EpCAM_lo，CD49f^hi）分别占96.9%和1.73%。在海藻酸盐微球中，管腔细胞和基底细胞分别占66.1%和2.47%。在观察管腔群体时，HR⁺管腔祖细胞（Lum. Prog.）在海藻酸盐微球中占4.96%，在新鲜肿瘤中占1.68%，而 HR^-小泡祖细胞（Alv. Prog.）的比例相当。这些结果表明海藻酸盐微球可以很好地保存类器官的管腔细胞，尤其是支持HR⁺管腔祖细胞。
• （c）微球中管腔类器官的EpCAM、CD49f和E-cad的免疫染色结果也证实了FACS结果。
• （d）具有管腔形成潜力（I、II）和无管腔形成潜力（III）的结构图像。

Immunofluorescence Staining of the Mammary Tumor Organoids

• （a）微球中的类器官用多聚甲醛固定，并用抗Ki67、CD133和纤连蛋白（fibronectin）的抗体染色。Ki67表达作为管腔型和实质型类器官中细胞增殖的指标，发现它们具有相似的Ki67表达，表明微球中的细胞增殖。
• （b）CD133是最常用的肿瘤干细胞标志物之一，在内皮祖细胞和乳腺中高度表达。管腔型和实质型类器官均被CD133抗体阳性染色，但发现管腔类器官表达的CD133水平高于实质型类器官。
• （c）纤连蛋白是一种调节细胞粘附、生长和迁移的蛋白质，是类器官培养的关键ECM成分。在管腔型类器官中，纤连蛋白主要存在于实质和管腔类器官之间的连接处，而在实质型类器官中，纤连蛋白主要分布在边缘。免疫染色分析表明，在海藻酸盐微球中培养的类器官可以保持主要活性。
• （d） 在海藻酸盐微球中形成的类器官的H&E染色。表明类器官与新鲜PyMT肿瘤组织相似的结构。作者在这里发现小鼠乳腺肿瘤类器官，尤其是管腔型，可以直接从海藻酸盐中的肿瘤块中提取，无需任何功能化。

Mechanics of Luminal Organoids Measured in Alginate Microbeads

　　具有生理功能的上皮组织主要依赖于通常由管腔组成的复杂结构。 管腔的紊乱或丧失通常与发育缺陷、炎症反应和癌症有关。充满液体的管腔由于其不可压缩性，可以传递液压力以协调整个器官甚至胚胎规模的细胞功能。管腔力学施加的应力可以改变组织的几何形状和张力分布。 这些力学和形态的变化可以直接指导细胞行为和命运，通常是通过机械转导。因此，管腔力学在组织形态发生中起着至关重要的作用。

　　类器官管腔的形成源于机械和生化信号的相互作用。已经建立了各种方法来测量管腔压力，凝胶变形试验是一种非侵入性和直接的方法，能够实现相对较宽的压力范围。然而，只有当管腔尺寸增长到与胶囊尺寸相当时，这种方法才能监测管腔压力。此外，它需要胶囊的薄壁，对制造技术和技能构成挑战。在这里，我们基于TWPV模型理论建立了海藻酸盐微球中管腔类器官的力学分析，可以计算整个类器官发育的力学。

　　TWPV模型公式如下，其中m = (1 − 2v)/(1 + v)，v为泊松比（Poisson’s ratio），即为材料的横向变形系数，G是材料的剪切模量，Δu是膨胀位移。
$$
P=\frac{-4G(b^3-a^3)}{2ma^4+ab^3}Δ𝑢
$$
　　切向应力的公式如下，其中x是a和b之间的radius of interest（不知道如何翻译）。：
$$
P=\frac{a^3P}{2(b^3-a^3)}(2+\frac{b^3}{x^3})
$$

• （a）海藻酸盐微球中管腔类器官的管腔压力和拉伸应力。
• （b）基于TWPV理论的光膨胀模型及其主要参数。其中，a是内半径，b是外半径，r是壁厚，P是管腔压力。
• （c）海藻酸盐微球中心的类器官的白光图像及膨胀时的荧光图像。由于海藻酸盐是一种线弹性材料，可以使用TWPV模型 （b < 10 r）来计算压力。在TWPV模型的理论中，外半径不会随着管腔的扩大而发生很大变化，图中微球中心管腔类器官的白光成像支持TWPV理论。荧光下证实了没有海藻酸盐进入类器官的管腔内，此外荧光藻酸盐允许更显著地观察变形。
• （d）具有单层细胞连接的类器官的荧光图像。
• （e）管腔半径与管腔压力（I）和切向应力（II）的关系。
• （f）管腔压力为2 kPa（①）时微球上的应力分布及其沿半径（II）的分布。应力沿半径显著减小，这表明海藻酸盐微球的整体尺寸在半径上不会发生太大变化。
• （g）从海藻酸盐微球中挤出的大类器官 （I）；管腔压力导致驼峰暴露在外面（II），是由高管腔压力引起的；从海藻酸盐微球中释放的大类器官（III），太大的类器官会穿透藻酸盐微珠，但并不能在培养皿中长期维持形态。

　　根据文献，管腔的初始半径a设置为20 µm，微珠的初始外半径b设置为230 µm，海藻酸盐的剪切模量为203 Pa。藻酸盐的浓度从1 wt%开始。然而当将海藻酸盐与细胞沉淀混合时，混合了一小部分培养基，导致海藻酸盐的最终浓度低于1 wt%。因此，作者参考了大约0.7%海藻酸盐的剪切模量。根据等式（1），管腔压力与管腔半径之间的关系如图5e-I所示。可以看到，当管腔直径达到150 µm时，管腔压力约为2 kPa，低于3 kPa，适用于海藻酸盐胶囊中的实体瘤球体。有趣的是，它比直径为100 µm（1.5 ± 0.3 kPa）的哺乳动物胚胎产生的压力略高。 结果还表明，这些类器官的管腔压力远高于在无支架培养基中培养的上皮管腔压力（0.12 kPa）。 根据等式（2），切向拉伸应力与管腔半径之间的关系如图5e-II所示。当管腔直径达到 150 µm时，切向拉伸应力达到1.1 kPa。先前的报告表明，细胞单层可以以大约20%的延伸量承受这种压力，这支持了作者的观察。图5d管腔的荧光成像显示了单层细胞连接和类似伸展的性能。

Cellular Response and Luminal Pressure Relationship to Drug Treatment

　　药物筛选需要对类器官进行高通量培养和分析。我们将微珠装入琼脂糖微孔阵列，并分别用治疗乳腺癌的两种标准药物阿霉素、拉春库林A（latrunculin A） 或载体对照处理类器官。根据分布比估算，应该有8个仅包含管腔型类器官的微孔，17个同时包含管腔型和实质型类器官的微孔和27个仅含有实质型类器官的微孔。在这里，只关注管腔型类器官的细胞反应。

• （a）24小时后，阿霉素处理导致微球内的管腔结构塌陷和消失。
• （b）24小时后，拉春库林A处理组管腔结果仍然存在。
• （c）（a）与（b）的放大图。不同的反应大概是由两种药物的不同作用机制引起的。
  • 阿霉素通过嵌入和抑制大分子生物合成与 DNA 相互作用。这抑制了拓扑异构酶II的进程，拓扑异构酶II是一种放松DNA中超螺旋以进行转录的酶。它还可能增加醌型自由基的产生，这可能会破坏管腔结构。
  • 拉春库林A影响肌动蛋白的聚合，阻止肌动蛋白丝的聚合导致哺乳动物细胞形态的可逆变化。
• （d）药物处理后死细胞的荧光强度，针对最高强度进行了标准化。阿霉素荧光与钙黄绿素的荧光重叠。因此，用阿霉素处理的类器官仅用碘化丙啶进行分析。24小时后拉春库林A组的强度要略高于阿霉素组。
• （e）不同大小的类器官中阿霉素摄取的荧光图像。具有更大尺寸和更高管腔压力的类器官显示出更高的阿霉素摄取，大的类器官承受着强大的机械压力，导致细胞的更大程度的拉伸和变形，以提高细胞对药物的吸收。
• （f）阿霉素摄取、类器官大小和管腔压力的相关性。

Conclusions

• 已建立的类器官保持了它们的表型和且与新鲜肿瘤相似。
• 建立了基于海藻酸盐微球变形的TWPV模型来分析管腔类器官的力学。
• 海藻酸盐微球中的类器官用于药物筛选。类器官对阿霉素和拉春库林A 的反应显著不同。类器官的大小和管腔压力影响药物摄取。该平台为乳腺肿瘤类器官的管腔力学分析、高通量生成和药物筛选提供了一种通用且低成本的策略。

Reference

Fang G, Lu H, Fuente L R De La, et al. Mammary Tumor Organoid Culture in Non-Adhesive Alginate for Luminal Mechanics and High-Throughput Drug Screening[J]. Advanced Science, 2021, n/a(n/a): 2102418.